circRNA体外合成：

体外转录（IVT）：

关于RNA前体的批量制备，常用的方法是体外转录(IVT)。IVT反应以含T7启动子的线性化质粒DNA为模板，在T7 RNA聚合酶作用下，以三磷酸核苷(NTPs)为底物合成线性RNA。

体外环化：

RNA的体外环化策略包括化学连接法、酶法连接和PIE核酶法。其中化学连接和酶法连接适用于较短RNA的环化，片段大于100 nt时，环化率会大幅降低，而基于内含子序列的核酶法，可实现1 kb~8 kb RNA的环化。

circRNA产物纯化:

除目标环状RNA（circRNA）外，IVT和体外环化反应混合物中还包括未消耗底物和反应副产物，例如NTPs、酶、金属离子、线性RNA前体、nicked circRNA、内含子片段等，因此需进行产物的纯化。 实验室常用的RNA纯化方法包括氯化锂沉淀、磁珠纯化，能够去除RNA以外的物质，但无法去除与circRNA性质接近的RNA杂质，如线性RNA前体、nicked circRNA等，因此存在免疫原性风险。用于动物试验的circRNA通常需更高的纯度，更严格的完整circRNA控制标准，更偏向于使用层析纯化方案。