mRNA IVT模板设计：

体外转录（IVT）是常见的RNA体外合成策略，可以协助我们高效地获得目标转录本。IVT是一种依赖于DNA模板的过程，常用的IVT模板类型是线性化质粒DNA或PCR产物。

质粒DNA模板

质粒DNA模板的必要元件包括启动子序列、目标mRNA序列和线性化酶切位点。

      启动子序列：DNA序列中的启动子序列RNA聚合酶（RNAP）识别后，在RNAP作用下将DNA转录为RNA。来源于T7噬菌体的T7 RNA聚合酶具有较高的特异性和RNA合成活性，是最常用的RNA聚合酶。

      线性化酶切位点：使用限制性内切酶在目标基因的下游进行切割,能够避免RNA聚合酶的过度转录。IIS型限制性内切酶是理想的线性化内切酶,能够确保polyA的完整性,且不留下多余的核苷酸。

      mRNA序列：即目标转录本序列。

用于IVT反应的质粒DNA模板的具体设计策略如下：

质粒DNA模板	序列设计/优化策略
启动子序列	常见的T7启动子及其变体： GG模板：TAATACGACTCACTATAGGG，适用于酶法加帽或第二代帽类似物ARCA； AG模板：TAATACGACTCACTATAAGG，匹配第三代帽类似物Clean Cap AG； AT模板：TAATACGACTCACTATAAT，对应帽类似物CleanCap AU (saRNA)。
线性化酶切位点	IIS型限制性内切酶切割位点在识别位点之外，是mRNA转录模板线性化的首选酶，例如BspQⅠ、BsaⅠ。
目标mRNA序列	包括5’Cap（帽结构）、5’UTR（非编码区域）、ORF（开放性阅读框）、3ʹUTR和3’polyA尾（多聚腺苷酸尾）。

PCR模板

PCR产物也是IVT RNA的常用模板，其关键组成元件包括启动子序列、以及与目标mRNA对应的模板序列。启动子序列的设计策略与质粒DNA模板一致。