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如果以环状质粒DNA为模板，基于RNA聚合酶的体外转录不会在预想的末端终止，而是产生长度不一的转录本。使用限制性内切酶在目标基因的下游进行切割，能够避免RNA聚合酶的过度转录。因此，应在质粒DNA模板中、mRNA编码序列的下游合理设计线性化酶切位点。
IIS型限制性内切酶是mRNA转录模板线性化的首选酶，例如BspQⅠ、BsaⅠ。这是因为IIS型限制性内切酶的切割位点在识别序列之外，不会留下多余的核苷酸，可以确保polyA尾的完整性。