抗体偶联LNP实验教程！宾大Mitchell团队Nature Protocol发文

2026-05-22

该实验教程基于宾夕法尼亚大学Michael J. Mitchell团队2026年3月9日在《Nature Protocols》上发表的研究成果：Preparation of targeted lipid nanoparticles for precision nucleic acid delivery，旨在为实验室人员提供制备抗体偶联靶向脂质纳米颗粒（tLNP）的标准化流程。更多实验细节请查看文献原文（添加小编微信获取PDF原文：188 5265 8090）。

该方案解决了传统LNP在体内递送时主要蓄积于肝脏、难以进入特定细胞或肝外组织的局限性。其核心优势在于：

1. 反应稳定性高：采用应变促进的叠氮-炔环加成（SPAAC）点击化学，反应条件温和（室温），生成的三唑键在生理环境下及还原压力下极度稳定。
2. 生物正交性强：SPAAC反应对氧气和水不敏感，且具有高度的选择性，能最大程度保留抗体活性和LNP的结构完整性。
3. 模块化设计：该流程具有高度的通用性，兼容任何LNP配方、抗体类型或核酸载荷（如mRNA、siRNA、pDNA等）。
4. 无需特殊设备：仅使用离心机、微流控设备和重力色谱柱即可完成制备。

01 实验须知

关键试剂与耗材：

• 叠氮脂质（接口）：DSPE-PEG2000-azide（Avanti Polar Lipids，货号：880228）。
• 抗体标记试剂：TFP ester-PEG(4)-DBCO（Thermo Fisher Scientific，货号：C20039）。
• 纯化树脂：Sepharose CL-4B（Millipore Sigma，货号：CL4B200）。
• 检测计：Quant-it RiboGreen（Thermo Fisher Scientific，货号：R11491）。
• 离心管/膜：10-kDa及100-kDa MWCO超滤管。

实验时长：

• 抗体准备与标记：0.5–1天。
• LNP制备与偶联：1–2天。
• 纯化与理化表征：1天。
• 体内外验证：3–4天。

经验之谈（重点）：

• 彻底清除叠氮化钠：商业抗体通常含有叠氮化钠防腐剂，它会与DBCO反应，因此标记前必须进行彻底的缓冲液置换。
• 严格控制标记度（DOL）：标记度建议目标为6，过高会导致标记位点靠近抗体结合界面，从而影响抗原亲和力，甚至在体内诱发免疫反应。
• 确保SEC柱容积：SEC重力柱的树脂装填体积必须≥20 ml，否则无法有效分离tLNP与游离抗体。
• 防止树脂干燥：纯化柱在操作过程中必须始终保持湿润，一旦干燥会出现裂缝，导致分离失败。
• 禁止冻融：制备好的tLNP应于4 °C保存并在2周内使用，严禁冷冻。

02 详细的实验流程

一、 抗体前处理：脱盐、浓缩与酶切 (Part 1)

1. 缓冲液置换：使用脱盐柱（1,500g离心1-2分钟）或20-kDa透析卡，将抗体置换至超纯水中。

目的：去除干扰标记的叠氮化钠，并确保浓度达到1–2 mg/ml的最佳标记范围。

2. 抗体片段化（可选）：根据抗体亚型选择合适的酶（如IgG1用Ficin，IgG2a用Pepsin），切除Fc段生成F(ab')2片段。

目的：减少Fc段引起的免疫原性或非特异性清除。

二、 抗体DBCO标记与DOL表征 (Part 2)

1. 配制DBCO溶液：将TFP ester-PEG(4)-DBCO溶解于无水DMSO中，配置成3.5 mM储存液。
2. 偶联标记：按10–20倍摩尔过量将DBCO加入抗体溶液中，在恒温混匀仪上室温、400 rpm震荡2小时。
3. 标记纯化：使用Zeba脱盐柱（1,500g离心2分钟）去除多余的游离DBCO。
4. 计算DOL：利用紫外吸光度（280/309 nm）计算抗体的标记度，确保DOL接近6。

三、 Azide-LNP的合成与抗体偶联 (Part 3)

1. 微流控混合：将含有叠氮脂质的有机相与mRNA水相按1:3的流速比（总流速约2,400 µl/min）在芯片内混合。
2. 荧光染色与透析：加入0.5 mol%的DiR染料后，针对PBS透析2小时以去除乙醇。
3. 点击化学偶联：按抗体:叠氮脂质 = 1:200的摩尔比加入标记后的抗体，在室温下350 rpm震荡孵育18–24小时。

四、 tLNP的纯化鉴定与质控 (Part 4-5)

1. SEC纯化：将偶联产物上样至装填有Sepharose CL-4B的20 ml重力柱，使用PBS洗脱并收集96个流分。

目的：利用尺寸差异让体积巨大的tLNP先流出，而较小的游离抗体滞留在柱内。

2. 识别tLNP组分：向各孔样品加入0.1% Triton X-100裂解LNP，随后加入RiboGreen试剂，荧光最强的孔即为目标组分。
3. 合并与浓缩：合并含有mRNA的孔，使用100-kDa超滤管在800g、4 °C下离心至目标体积。
4. 表征检测：通过DLS测量粒径（成功的偶联通常伴随粒径增加）和Zeta电位。

五、 体内外靶向效果评价 (Part 6-7)

1. 体内验证：通过尾静脉或球后注射（剂量如1.5 µg mRNA/小鼠），给药4–12小时后腹腔注射150 mg/kg荧光素，利用IVIS成像检测器官生物分布与发光信号。
2. 离体验证：针对激活后的T细胞（CD3/CD28 Dynabeads激活≥18小时），加入tLNP并在1、4、24小时点利用流式细胞术检测DiR（摄取）和报告蛋白（转染）。

Troubleshooting 速查表

Geisler HC, Battistini E, Thatte AS, Padilla MS, Mitchell MJ. Preparation of targeted lipid nanoparticles for precision nucleic acid delivery. Nat Protoc. 2026 Mar 9.